中藥指紋圖譜是指將某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖。 中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學成分系統(tǒng)研究的基礎上，主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性?！罢w性”和“模糊性”為其顯著特點。

構建方法

目前，中藥指紋圖譜技術已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效毛細管電泳法（HPCE）等色譜法以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認的三種常規(guī)分析手段。由于HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快、應用范圍廣等特點；中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，且積累較豐富的應用經(jīng)驗。

1、薄層色譜法（TLC）薄層色譜具有選用范圍廣,重現(xiàn)性好等優(yōu)點，常用于中藥各種成分的鑒別。用固定波長對薄層展開的各斑點作薄層掃描圖譜比目測的層析圖譜更為客觀準確，因而具有更好的指紋鑒別意義。但由于受薄層板的質量和開放式層析系統(tǒng)等外界因素的影響，易引起一定的實驗誤差。

2、氣相色譜法 - GC 氣相色譜是封閉性色譜，受外界影響較少，具有高性能、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點，適合于藥材及制劑中揮發(fā)性成分指紋圖譜的研究。一般使用質量型檢測器-氫火焰離子化檢測器（FID）。錢浩泉等用氣相色譜法建立了高良姜及其邊緣植物揮發(fā)油成分的指紋圖譜。具體應用中多與質譜聯(lián)用，不僅具有 GC 的高分離效能，而且兼?zhèn)淞速|譜鑒定的高靈敏度和準確性。

3、高效液相色譜法 - HPLC 高效液相色譜具有分離效率高，分析速度快，定量精密度高，檢測器種類多，穩(wěn)定性好等特點。不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，比氣相色譜法應用范圍更廣，樣品中大多數(shù)成分均可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，是構建指紋圖譜的主要方法之一。由于中藥成分的復雜性，構建指紋圖譜一般采用梯度洗脫，因為逐步提高流動相洗脫能力可獲得較多色譜峰，提供更多指紋信息。在考察條件時，要對指標成分和非指標成分都予以考慮，由于藥材中各種成分的吸收波長及對不同檢測器的響應不同，在構建指紋圖譜時也需要加以考慮。實際應用中多使用多種聯(lián)用技術，

充分利用各檢測器的互補性，從不同角度反映藥材及制劑的全貌，從各種圖譜中得到結構信息。

4、高速逆流色譜法 - HSCCC 它是目前國際上較新型的液－液分配色譜技術，利用相對移動的兩種互不相溶溶劑，在處于動態(tài)平衡的兩相中將具有不同分配比的組分分離。已有報道將 HSCCC應用于生物堿、黃酮、木脂素、蒽醌等天然產(chǎn)物的分離分析。具有分離效率高，溶劑用量少，無吸附，樣品回收率高,重現(xiàn)性好和適用范圍廣等優(yōu)點。

5、高效毛細管電泳法 - HPCE 高效毛細管電泳技術是以高壓電場為驅動，毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)高效快速分離的新型電泳技術。毛細管電泳的廣泛應用取決于其多變的分離模式，幾乎涉及分析化學中所有的分離對象，小到無機離子，大到蛋白質和高分子聚合物，也能夠分析不帶電荷的中性物質。具有所需樣品少、溶劑消耗少、抗污染能力強、可直接分析水溶液等優(yōu)點。其中毛細管區(qū)帶電泳 - CZE 和膠束電動毛細管電泳色譜 - MECC 是中草藥分析中最常見的兩種模式。但該方法的重現(xiàn)性有待提高。

6、紫外可見光譜 - UV 紫外可見光譜反映不同化學物質的電子共扼體系特征，具有加和性，對于混合物的鑒別專屬性差，分辨率低，故紫外光譜很少用于指紋圖譜的構建。

7、紅外光譜和近紅外光譜 - IR 紅外光譜是由分子的振動－轉動能級躍遷產(chǎn)生的光譜，紅外光譜具有高度的特征性。近紅外光譜法在中藥質量控制方面有較好的應用前景。

8、核磁共振法 - NMR 從純有機化合物的核磁共振氫譜上可獲得結構信息，包括各類質子的化學位移、數(shù)量核偶合關系。核磁共振譜具有高度的重現(xiàn)性和特征性，易于解析和進一步研究，可評價藥材和中成藥質量的均一性和穩(wěn)定性。

9、質譜法 - MS 將中藥提取液置質譜儀中進行電子轟擊電離，可獲得提取液中化學成分的質譜指紋譜，不同中藥提取液所含成分不同，所得質譜圖顯示的分子離子峰及進一步，裂解碎片峰不一致，可供鑒別。

10、X射線衍射法：物質被X射線照射可產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象，只要某一混合物的組成是恒定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特征圖譜。該法具有圖譜指紋專屬性強，信息量大,所需樣品量小等諸多優(yōu)點，X射線衍射法在動物類藥材鑒定與辨別中有獨特的優(yōu)勢。

11、分子生物學法 - DNA 利用聚合酶鏈反應從不同生物樣品中人工合成 DNA片斷，而這種 DNA片斷的大小、數(shù)目可因不同的生物而異，故稱之為 DNA指紋圖譜。該技術具有重復性好、靈敏度高的優(yōu)點。限制性內切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）是最常用的構建 DNA指紋圖譜的方法，但該法費時費力，應用受到限制。隨機擴增多態(tài) DNA（RAPD）標記，可以在特異 DNA序列尚不清楚的情況下，檢測DNA的多態(tài)性，這是構建中藥指紋圖譜的新方法，具有極好的應用前景。羅志勇等采用 RFLP技術,分析了人參、西洋參基因 DNA指紋圖譜。

分析、技術

隨著分離分析技術的發(fā)展，中藥質量研究也由過去“四大鑒別” - 基元鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別發(fā)展到反映中藥材全貌的指紋體系，即反映中藥材的多元化學組成特性的化學指紋圖譜和反映生物體 - 除礦物、樹脂類外 特性的基因指紋圖譜，從有效成分和遺傳物質兩方面實現(xiàn)對中藥材的質量控制，為中藥材以及中成藥提供綜合的和可量化的質量評價方法。

1、化學指紋圖譜

中國中藥指紋圖譜的研究已有相當?shù)幕A，最早可以追溯到20世紀60年代，如采用薄層色譜、紫外光譜、紅外光譜法來描述中藥材主要成分的特征，這是早期的原始的指紋圖譜，具有直觀、在簡單情況下容易比較差異的優(yōu)點。隨著分析技術的飛速發(fā)展和微電腦的廣泛應用，基于化學計量法的中藥指紋圖譜的研究方法向高效、靈敏、專屬、智能化、聯(lián)用型的方向發(fā)展，高效液相、高效毛細管電泳、高速逆流色譜、核磁共振、近紅外光譜等新興分析技術的應用和各種數(shù)學分析方法的運用，為中藥指紋圖譜的研究與發(fā)展提供了廣闊的前景。

2、紫外光譜指紋圖譜

紫外光譜法是1995年以前指紋圖譜常用的方法。由于不同中藥所含的不飽和程度有差異，因而導致其紫外吸收曲線的形態(tài)、峰位、峰強度亦有差異，以此達到鑒別效果。常用導數(shù)光譜及結合各種數(shù)學分析法來消除樣品中的一些無關吸收，排除原圖譜中的某些干擾。

3、熒光光譜

中藥注射劑常含熒光性物質，但因不同注射劑所含具體熒光性物質不同，同種注射劑又因廠家的具體配方的差異或制備工藝條件的波動，均會使其特征的熒光激發(fā)、發(fā)射光譜不同或其強度呈現(xiàn)差異；根據(jù)注射劑的熒光圖譜的差異達到快速鑒別、認定和控制配方、工藝的目的。

熒光光譜不像紅外光譜那樣具有明顯的指紋特征，但具有高靈敏度的顯著優(yōu)勢，且差異更為一目了然，易于判斷，因此，可以作為紅外光譜指紋技術的一種補充，用于中藥注射液的鑒別和認定，以及生產(chǎn)工藝的控制和成藥熱穩(wěn)定性研究等。

4、色譜指紋圖譜

色譜指紋圖譜最實用、應用也是最廣泛。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，是當前符合中藥特色的評價中藥真實性、穩(wěn)定性和一致性的質量控制模式之一。色譜指紋圖譜最大的優(yōu)點是具有分離的功能。

TLC為傳統(tǒng)的定性、半定量分析方法，在中國“七五”、"十一五”及“九五”公關課題中有大量采用薄層色譜法進行地道藥材的定性鑒別。該法操作簡單、分析速度快速、一次分析樣品多，提供信息量大，用固定波長對薄層展開的各個斑點進行掃描，所得掃描圖譜比目測的層析圖譜更加客觀準確，因此具有較好的指紋鑒別意義。其最大的缺點是重現(xiàn)性以及精密度差，所以在指紋圖譜應用中受到限制，但可以作為中藥指紋圖譜研究的借鑒和補充。

5、氣相色譜 - GC指紋圖譜

GC最適合于各種主含易揮發(fā)性成分藥材及其制劑的分析，尤其是毛細管氣相色譜法，分辨率很高，往往一個色譜可以分出百個成分。該法靈敏度高、分離度好，分析速度快，但是分析范圍只是局限于低沸點成分，是指紋圖譜研究的主要方法之一。

HPLC適用于成分復雜而不易分離的分析對象，具有分離效能高，靈敏度高，分析速度快，不需要氣化，檢測手段多等優(yōu)點，是目前指紋圖譜技術中用途最廣泛的一種方法。

HSCCC是當前國際流行的新型的液-液分配技術。應用動態(tài)液一液分配原理，利用相對移動互不混溶的兩相溶劑，在處于動態(tài)平衡的兩相中將具有不同分配比的樣品組分離。其特點是不用固相載體作固定相，克服了樣品吸附、損失、峰形拖尾問題。操作更為簡便，容易掌握。對樣品的預處理要求低，僅需一般粗提物即可。該技術的回收率高，能實現(xiàn)梯度操作，亦能重復進樣，在中藥質量分析控制研究中，尤其在指紋圖譜研究中有較好的應用前景。

毛細管電泳 - CE又叫高效毛細管電泳 - HPCE，以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法，是近年發(fā)展起來的一種新的分離技術，是電泳技術和層析技術結合的產(chǎn)物，兼有高壓電泳的高速高分辨率及HPLC的高效率等特點，其選擇性與高效液相有很大的互補性。因此在指紋圖譜研究方面的應用越來越廣泛。

聯(lián)用技術：由于中藥復方制劑成分復雜，現(xiàn)行的各種單一測定方法給出信息少均無法建立較完善的指紋圖譜，因而有人提出建立多維指紋譜嘗試解決這一問題。所謂多維，即采用多種分析儀器聯(lián)用的模式來測定指紋圖譜，各譜圖間相互補充信息，可對復雜供識品有更清晰完整的認識。目前最常用的是高效液相（或氣相色譜）/二極管陣列檢測器/質譜/質譜聯(lián)用方式 - HPLC或GC/ DAD/ MS/ MS 所得的多維指紋圖譜。多維譜的建立既能較系統(tǒng)、較完整地解決中藥復方制劑質量控制的難題，又為中藥研究中缺乏標準品的難題提供了種新的解決途徑。

6、X射線衍射法

當某一物質進行衍射分析時，該物質被X射線照射而產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象?？煞譃閱尉衍射法與粉末X衍射法。物質組成、晶型、分子內成鍵方式、分子的構型等決定該物質產(chǎn)生特有的衍射圖譜。如果該物質是一混合物，X-射線衍射圖是各混合物各組分衍射效應的疊加。只要這一混合物的物質組成是恒定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特征圖譜。X -衍射指紋圖譜具有指紋性強，圖譜穩(wěn)定可靠等特點。尤其是X衍射Fourier譜分析法可用于動物類藥材的鑒定與偽品識別。

7、核磁共振 - NMR指紋圖譜

核磁共振氫譜 - 1H-NMR是鑒定有機化合物結構的重要的方法之一。它可以獲得化合物的包括各類質子的化學位移、數(shù)量、偶合關系等多個結構信息。如可以用一定程序獲取植物類中藥的特征性化學成分 - 或化學成分組的總提取物，同時這些特征的化學成分的含量是相對固定的，則在規(guī)范的提取分離條件下，植物類中藥的1H-NMR圖譜與植物品種存在著嚴格的對應關系，沒有混淆的可能性。圖譜中的信號強弱反映了混合物中各組分的相對含量。在對特征總提物進一步分離得到單體后，通過結構鑒定和NMR研究，可以對指紋圖譜中的各特征譜線進行歸屬。

8、分子生物指紋圖譜

隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，DNA分子技術己越來越多的用于中藥材品種鑒別的研究。分子生物指紋圖譜是指采用分子標記技術得到的某一中藥材品種的DNA指紋圖譜。如對于人參、西洋參一類中藥材的鑒別，用傳統(tǒng)的方法 - 性狀、顯微、理化等鑒別方法都顯片面性，結果往往很模糊，因而其產(chǎn)地、生長年限、加工方式等因素與其性狀和成分不呈很強的相關性，但應用分子生物學技術可以迎韌而解。