ELISA試劑盒在國內(nèi)有許多種叫法：例如：ELISA檢測試劑盒、ELISA Kit、酶聯(lián)免疫試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、酶聯(lián)免疫分析試劑盒、酶免試劑盒等，比較常見的叫法是ELISA檢測試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒等ELISA試劑盒自從60-70年代問世以來，得到全世界科研工作者的認可及推崇，在歐美及中國獲得很大的推廣，尤其是國內(nèi)生化領(lǐng)域的長足發(fā)展。Elisa生物試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學檢驗的各領(lǐng)域中。

原理

免疫測定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何優(yōu)質(zhì)的診斷試劑離不開優(yōu)質(zhì)的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標記物如酶標結(jié)合物則通過各種化學合成方法制備。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測定試劑幾成為現(xiàn)實的新一代試劑，各種新型使用的測定方法也不斷出現(xiàn)。

HBsAg試劑特點（檢測模式：臨床抗體夾心法）：包被抗體為山羊多抗。多抗具有高親和性和對抗原各種表位的反應(yīng)性。酶表抗體為與HBsAg有不同結(jié)合位點的鼠復合單位，可測得HBsAg變異樣品，提高檢測的特異性（99.98%）提高檢測的靈敏度，應(yīng)用Parl Ehrich 學說（PEI）HBsAg標準品，對ad標準品的靈敏度為0.05ng/ml對ay標準品靈敏度為0.025ng/ml

ELISA檢測試劑盒應(yīng)用定性夾心免疫檢測技術(shù)，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是中國型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強的肽段，分別來自于該毒株的開放閱讀框2和開放閱讀框3。將樣品或標準品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗體，這些抗體就會與HEV 的多肽抗原結(jié)合，并固定在上面，洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。

然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根過氧化物酶）酶結(jié)合物，經(jīng)第二次孵育后，酶結(jié)合物就會與第一次孵育結(jié)合上的HEV IgM抗體相結(jié)合，洗板除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時會發(fā)生酶-底物反應(yīng)，只有那些含有HEV IgM抗體和酶結(jié)合物所形成的復合物的孔才會發(fā)生顏色變化，加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應(yīng)，并在波長: 450nm處測量O.D.值,按照本HEV IgM抗體elisa試劑盒的測試標準, O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認為是初試陽性。

用途

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。

加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。

然而，影響Elisa試驗結(jié)果的因素很多，故加強各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學的優(yōu)點。

特點

一、高效、靈敏、特異的抗體；

二、穩(wěn)定的重復性和可靠性；

三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體；

四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型；

五、節(jié)省實驗經(jīng)費。

elisa試劑盒回收率是反應(yīng)待測物在樣品分析過程中的損失的程度，損失越少，回收率越高，如果作標液1PPM，就是1毫克/升，而作出標準數(shù)據(jù)為0.99毫克/升，就是說你的回收率是99%，這個與真實成分有密切的關(guān)系，說明方法的準確度。比如水中總無機氯含量測定，樣品水中含有無機氯20mg/L，取100mL被測水樣品，加入0.1mL濃度為10mg/mL的含無機氯標準樣品，測定時忽略體積變化，如果測定出樣品中無機氯為2.98mg/L，則認為回收率為99%。

制備方法

包括以下步驟：

1抗原表位的計算機篩選；

2抗原的制備；

3血清的采集；

4間接ELISA方法的建立；

5間接ELISA方法的敏感性和特異性驗證；

6試劑盒的穩(wěn)定性驗證；

7對屠宰場進行臨床檢測。該方法簡單、快速、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性合格、重復性好。應(yīng)用本發(fā)明制得的試劑盒能有效檢出感染豬的戊型肝炎病毒，適用于大批量發(fā)病樣本的檢測，可用于豬戊肝的快速診斷，并預防、控制豬戊肝病毒的流行和阻斷戊肝病毒由豬向人傳播。

組成結(jié)構(gòu)

1、血清：操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細胞迅速小心地分離。

2、血漿：EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、細胞上清液：1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。

5、保存：如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

此IBL試劑盒能用于小鼠血清,EDTA血漿,細胞上清中白介素-6的定量檢測

操作方法

雙抗體夾心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

3.加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

間接法

1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜；

2.次日洗滌3次；

3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌；

4.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml；

5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌；

6.’最后一遍用DDW洗滌。

其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

發(fā)展前景

臨床測定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學的發(fā)展，而方法學的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進步更新和型標記物的應(yīng)用。分子生物學正在并最終肯定會讓對整個生命科學有一個全面而徹底的認識，其對免疫測定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的，對以前一些難以檢測的生物活性物質(zhì)的測定，并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。

測試要求

做好對照

正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

實驗條件的選擇

在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1）固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml。

（3）酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。

（4）酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

應(yīng)用

ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴大。

可概括四個方面：

1、免疫酶染色各種細胞內(nèi)成份的定位。

2、研究抗酶抗體的合成。

3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。

4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。