葉綠素（Chlorophyl）是高等植物和其它所有能進行光合作用的生物體含有的一類綠色色素。葉綠素有多種，例如葉綠素a、b、c和d，以及細菌葉綠素和綠菌屬葉綠素等，與食品有關的主要是高等植物中的葉綠素a和b兩種。其結構共同特點是結構中包括四個吡咯構成的卟啉環(huán)，四個吡咯與金屬鎂元素結合。

葉綠素存在于葉片的葉綠體內(nèi)。在葉綠體內(nèi)，葉綠素可看成是嵌在蛋白質(zhì)層和帶有一個位于葉綠素植醇鏈旁邊的類胡蘿卜素脂類之間。當細胞死亡后，葉綠素即從葉綠體內(nèi)游離出來，游離葉綠體很不穩(wěn)定，對光或熱都很敏感。

葉綠素是植物進行光合作用時必須的催化劑。葉綠素a為藍黑色晶體，熔點150-153℃，葉綠素b為深色晶體，熔點120-130℃。

基本簡介

葉綠素，是植物進行光合作用的主要色素，是一類含脂的色素家族，位于類囊體膜。葉綠素吸收大部分的紅光和紫光但反射綠光，所以葉綠素呈現(xiàn)綠色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。葉綠素為鎂卟啉化合物，包括葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素和細菌葉綠素等。葉綠素不很穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環(huán)中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素有造血、提供維生素、解毒、抗病等多種用途。

分類

葉綠素分為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c、葉綠素d、葉綠素f、原葉綠素和細菌葉綠素等。

葉綠素的發(fā)現(xiàn)

德國化學家韋爾斯泰特，在20世紀初，采用了當時最先進的色層分離法來提取綠葉中的物質(zhì)。經(jīng)過10年的艱苦努力，韋爾斯泰特用成噸的綠葉，終于捕捉到了葉中的神秘物質(zhì)——葉綠素，正是因為葉綠素在植物體內(nèi)所起到的奇特作用，才使我們?nèi)祟惖靡陨?。由于成功地提取了葉綠素，1915年，韋爾斯泰特榮獲了諾貝爾化學獎。

性質(zhì)及結構

化學結構

葉綠素分子結構19世紀初，俄國化學家、色層分析法創(chuàng)始人M.C.茨韋特用吸附色層分析法證明高等植物葉子中的葉綠素有兩種成分。德國H.菲舍爾等經(jīng)過多年的努力，弄清了葉綠素的復雜的化學結構。1960年美國R.B.伍德沃德領導的實驗室合成了葉綠素a。至此，葉綠素的分子結構得到定論。

葉綠素分子是由兩部分組成的：核心部分是一個卟啉環(huán) - porphyrin?ring，其功能是光吸收；另一部分是一個很長的脂肪烴側鏈，稱為葉綠醇（phytol），葉綠素用這種側鏈插入到類囊體膜。與含鐵的血紅素基團不同的是，葉綠素卟啉環(huán)中含有一個鎂原子。葉綠素分子通過卟啉環(huán)中單鍵和雙鍵的改變來吸收可見光。各種葉綠素之間的結構差別很小。如葉綠素a和b僅在吡咯環(huán)Ⅱ上的附加基團上有差異：前者是甲基，后者是甲醛基。細菌葉綠素和葉綠素a不同處也只在于卟啉環(huán)Ⅰ上的乙烯基換成酮基和環(huán)Ⅱ上的一對雙鍵被氫化。

化學性質(zhì)

高等植物葉綠體中的葉綠素主要有葉綠素a和葉綠素b兩種。它們不溶于水，而溶于有機溶劑，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。葉綠素a分子式：C55H72O5N4Mg；葉綠素b分子式：C55H70O6N4Mg。在顏色上，葉綠素a呈藍綠色，而葉綠素b呈黃綠色。按化學性質(zhì)來說，葉綠素是葉綠酸的酯，能發(fā)生皂化反應。葉綠酸是雙羧酸，其中一個羧基被甲醇所酯化，另一個被葉醇所酯化。

葉綠素分子含有一個卟啉環(huán)的“頭部”和一個葉綠醇的“尾巴”。鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，偏向于帶正電荷，與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負電荷，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質(zhì)結合。葉醇是由四個異戊二烯單位組成的雙萜，是一個親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性。葉綠素不參與氫的傳遞或氫的氧化還原，而僅以電子傳遞（即電子得失引起的氧化還原）及共軛傳遞（直接能量傳遞）的方式參與能量的傳遞。

卟啉環(huán)中的鎂原子可被氫離子、銅離子、鋅離子所置換。用酸處理葉片，氫離子易進入葉綠體，置換鎂原子形成去鎂葉綠素，使葉片呈褐色。去鎂葉綠素易再與銅離子結合，形成銅代葉綠素，顏色比原來更穩(wěn)定。人們常根據(jù)這一原理用醋酸銅處理來保存綠色植物標本。葉綠醇是親脂的脂肪族鏈，由于它的存在而決定了葉綠素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有機溶劑中。由于在結構上的差別，葉綠素a呈藍綠色，b呈黃綠色。在光下易被氧化而退色。葉綠素是雙羧酸的酯，與堿發(fā)生皂化反應。

葉綠素不是很穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環(huán)中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素溶液能進行部分類似光合作用的反應，在光下使某些化合物氧化或還原。人工制備的葉綠素膜在光下能產(chǎn)生光電位和光電流，也能催化某些氧化還原反應。

光合作用

光合作用是指綠色植物通過葉綠體，把光能用二氧化碳和水轉化成化學能，儲存在有機物中，并且釋放出氧的過程。光合作用的第一步是光能被葉綠素吸收并將葉綠素離子化。產(chǎn)生的化學能被暫時儲存在三磷酸腺苷（ATP）中，并最終將二氧化碳和水轉化為碳水化合物和氧氣。

1864年，德國科學家薩克斯做了這樣一個實驗：把綠色葉片放在暗處幾小時，目的是讓葉片中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗掉。然后把這個葉片一半曝光，另一半遮光。過一段時間后，用碘蒸氣處理葉片，發(fā)現(xiàn)遮光的那一半葉片沒有發(fā)生顏色變化，曝光的那一半葉片則呈深藍色。這一實驗成功地證明了綠色葉片在光合作用中產(chǎn)生了淀粉。

1880年，德國科學家恩吉爾曼用水綿進行了光合作用的實驗：把載有水綿和好氧細菌的臨時裝片放在沒有空氣并且是黑暗的環(huán)境里，然后用極細的光束照射水綿。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，好氧細菌只集中在葉綠體被光束照射到的部位附近；如果上述臨時裝片完全暴露在光下，好氧細菌則集中在葉綠體所有受光部位的周圍。恩吉爾曼的實驗證明：氧是由葉綠體釋放出來的，葉綠體是綠色植物進行光合作用的場所。

將一片脫去淀粉的紫羅蘭葉片放在陽光下數(shù)小時之后用碘試劑檢測，可以發(fā)現(xiàn)只有葉片上綠色的區(qū)域變色而白色區(qū)域沒有，也就是說只有綠色區(qū)域有淀粉存在。這顯示了光合作用在缺乏葉綠素的情況下無法進行，葉綠素存在是光合作用的必要條件。

熒光磷光現(xiàn)象

葉綠素的可見光波段的吸收光譜，在藍光和紅光處各有一顯著的吸收峰，吸收峰的位置和消光值的大小隨葉綠素種類不同而有所不同。葉綠素a最大的吸收光的波長在420-663nm，葉綠素b的最大吸收波長范圍在460-645nm。當葉綠素分子位于葉綠體膜上時，由于葉綠素與膜蛋白的相互作用，會使光吸收的特性稍有改變。

葉綠素的酒精溶液在透射光下為翠綠色，而在反射光下為棕紅色。

這個紅光就是葉綠素受光激發(fā)后發(fā)射的熒光。這個現(xiàn)象就是熒光現(xiàn)象。其主要原理是由于葉綠素有兩個不同的吸收峰。葉綠素吸收光的能力極強，如果把葉綠素的丙酮提取液放在光源與分光鏡之間，可以看到光譜中有些波長的光被吸收了。因此，在光譜上就出現(xiàn)了黑線或暗帶，這種光譜叫吸收光譜。

葉綠素吸收光譜的最強區(qū)域有兩個：一個是在波長為640nm-660nm的紅光部分，另一個在波長為430nm-450nm的藍紫光部分。對其他光吸收較少，其中對綠光吸收最少，由于葉綠素吸收綠光最少，所以葉綠素的溶液呈綠色。葉綠素的丙酮提取液在透射光下是翠綠色的，而在反射光下是棕紅色的。葉綠素溶液的熒光可達吸收光的10%左右。而鮮葉的熒光程度較低，指占其吸收光的0.1%-1%左右。

熒光效應在植物生理學中有廣泛的應用。用這個效應可以研究植物的抗逆生理。因為在逆境下，植物的葉綠素會發(fā)生變換，研究其熒光，可以作為植物受逆境脅迫程度的指標。另外，還有一個磷光效應。就是當熒光出現(xiàn)后，立即中斷光源，用靈敏的光學儀器還可在短時間內(nèi)看到微弱紅光，這就是磷光。

生物合成代謝

葉綠素a的生物合成途徑，是由琥珀酰輔酶A和甘氨酸縮合成δ-氨基乙酰丙酸，兩個δ-氨基乙酰丙酸縮合成吡咯衍生物膽色素原，然后再由4個膽色素原聚合成一個卟啉環(huán)──原卟啉Ⅳ，原卟啉Ⅳ是形成葉綠素和亞鐵血紅素的共同前體，與亞鐵結合就成亞鐵血紅素，與鎂結合就成鎂原卟啉。鎂原卟啉再接受一個甲基，經(jīng)環(huán)化后成為具有第Ⅴ環(huán)的原脫植醇基葉綠素，后者經(jīng)光還原、酯化等步驟而形成葉綠素a。

葉綠素在活體內(nèi)也和其他物質(zhì)一樣處于不斷更新狀態(tài)。它被葉綠素酶分解，或經(jīng)光氧化而漂白。深秋時許多樹種葉片呈美麗的紅色，就是因為這時葉綠素降解速度大于合成速度，含量下降，原來被葉綠素所掩蓋的類胡蘿卜素、花色素的顏色顯示出來的緣故。葉綠素含N，Mg，類胡蘿卜素不含N，Mg。

在植物衰老和儲藏過程中，酶能引起葉綠素的分解破壞。這種酶促變化可分為直接作用和間接作用兩類。直接以葉綠素為底物的只有葉綠素酶，催化葉綠素中植醇酯鍵水解而產(chǎn)生脫植醇葉綠素。脫鎂葉綠素也是它的底物，產(chǎn)物是水溶性的脫鎂脫植葉綠素，它是橄欖綠色的。葉綠素酶的最適溫度為60-82℃，100℃時完全失活。

起間接作用的有蛋白酶、酯酶、脂氧合酶、過氧化物酶、果膠酯酶等。蛋白酶和酯酶通過分解葉綠素蛋白質(zhì)復合體，使葉綠素失去保護而更易遭到破壞。脂氧合酶和過氧化物酶可催化相應的底物氧化，其間產(chǎn)生的物質(zhì)會引起葉綠素的氧化分解。果膠酯酶的作用是將果膠水解為果膠酸，從而提高了質(zhì)子濃度，使葉綠素脫鎂而被破壞。

在活體綠色植物中，葉綠素既可發(fā)揮光合作用，又不會發(fā)生光分解。但在加工儲藏過程中，葉綠素經(jīng)常會受到光和氧氣作用，被光解為一系列小分子物質(zhì)而褪色。光解產(chǎn)物是乳酸、檸檬酸、琥珀酸、馬來酸以及少量丙氨酸。因此，正確選擇包裝材料和方法以及適當使用抗氧化劑，以防止光氧化褪色。

提取和分離方法

提取

葉綠素提取的準備工作是在一個半暗的房間里，室溫保持在25℃。提取步驟如下：

- 1取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。

- 2將粉碎的1000克綠葉放進加有少量的碳酸鈣的丙酮中（溫度20℃）進行萃取，直到過濾、清洗后的葉子碎片為無色。

- 3將過濾后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100mL丙酮的漏斗中，然后輕輕地旋轉，同時加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水溶雜質(zhì)被丟棄，只剩石油醚溶液。

- 4將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200mL80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黃綠色懸浮液。

- 5用無水硫酸鈉對懸浮液進行干燥，并將其滲入到3cm厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉類胡蘿卜素，使之只含有天然的葉綠素。

- 6含有天然葉綠素的蔗糖柱分兩層，綠層有4-10mm的葉綠素b層，另一藍層為2-6mm的葉綠素a層。

- 7將位于藍層正中的部分（約占藍層的一半）放入醚中，對此懸浮液進行過濾、洗提，用蒸餾水清洗，用硫酸鈉干燥，再用器皿進行過濾后，得到葉綠素a。

- 8將 - 6中的綠層中間部分移出，迅速放入醚中過濾、洗提，制成葉綠素b醚溶液。

分離

色譜法是一種很好的分離純化、鑒定有機化合物的重要方法，尤其是在微量分析中應用的更是廣泛。果蔬中色素主要包括脂溶性的胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素和水溶性的花青素。在提取實驗時，我們可以利用相似相溶的原理把水溶性的花青素濾掉，繼而可以利用薄層色譜、柱色譜、高效液相色譜對胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素進行分離，由于這三種色素的極性依次減弱，可以適當?shù)剡x擇單一的有機溶劑或者不同配比的混合溶劑作為展開劑和洗脫劑，確定最佳的優(yōu)化分離條件。

測定方法

葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法。不過目前應用最為廣泛的還是分光光度法。

葉綠素提取液的吸收光譜表明：有兩個強吸收峰，分別在紅光區(qū)和藍紫區(qū)，不同提取溶劑和原料所得的葉綠素溶液的吸收光譜比較相似。葉綠素a、葉綠素b的紅區(qū)最大吸收峰分別在663nm、645nm附近，在藍紫區(qū)分別為429nm、453nm附近。由于提取溶劑和原料不同，對葉綠素提取液進行光譜掃描后，所得的最大吸收值可能有較小范圍的浮動。

高效液相色譜 - HPLC定量檢測葉綠素含量準確率較高，效果很好。用甲醇和丙酮作為流動相，體積比為80：20時，同時在流動相中加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的冰醋酸，流速為1.0mL/min。利用每一種色素的色譜峰面積進行定量，葉綠素a、葉綠素b的定量可通過外標法由工作曲線求得。

穩(wěn)定性影響因子

光

在活體植物中，葉綠素得到了很好的保護，既可以發(fā)揮光合作用，又不會發(fā)生降解。但離體葉綠素對光照很敏感，光和氧氣作用可導致葉綠素不可逆的分解。在自然條件或以膠態(tài)分子團存在的水溶液中，葉綠素在有氧的條件下，可進行光氧化而產(chǎn)生自由基，因此一些研究人員認為葉綠素的光氧化降解必需有氧分子參與，而且其降解速率隨氧分子濃度的升高而加快。

單線態(tài)氧和羥基自由基是葉綠素光化學反應的活性中間體，可與葉綠素吡咯鏈作用而進一步產(chǎn)生過氧自由基和其他自由基，最終可導致卟啉環(huán)和吡咯鏈的分解既而造成顏色的褪去。當然影響光氧化的因素有很多，比如體系中的水分、溫度、光照時間、光照強度、光的波長范圍等等，在這些影響因素中主要有光照時間、光照強度、光的波長范圍、氧的濃度。目前在此方面的研究主要集中在自然光（復合光）對色素的影響，而且大多數(shù)研究不是很深人。對于單色光（不同波段的光）對葉綠素穩(wěn)定性的影響研究方面的報道卻較少。

葉綠素酶

已有研究表明，葉綠素酶是一種糖蛋白。葉綠素酶催化葉綠素結構中的植醇鍵而水解生成脫植葉綠素，是葉綠素降解中的關鍵酶。葉綠素酶是以葉綠素作為底物的，它是一種酯酶。脫鎂葉綠素也是葉綠素酶的底物，酶促反應的產(chǎn)物是脫鎂脫植葉綠素。葉綠素酶的最適反應溫度在60～80℃范圍，實驗證明，葉綠素酶在80℃以上其活性下降，100℃時已完全失活。

溫度

一些研究表明，葉綠素提取液在不同受熱溫度下，其降解速率曲線有明顯的拐點，葉綠素在80℃以下，降解速度較慢，90℃以上降解速度急劇加快?？傮w而言，隨著溫度的升高，葉綠素降解的速率是逐漸加快的，只是較低的溫度下降解速率不明顯。

pH值

體系的pH值是影響葉綠素穩(wěn)定性的一個重要因子，葉綠素在中性和弱酸弱堿性條件下較穩(wěn)定，相關研究表明：pH值在6～11之間葉綠素的保存率高達90%。但當體系的pH值下降到4時，葉綠素脫鎂反應的速度比較明顯，且隨著酸性的增強，破壞性越大。

氧氣

大多數(shù)文獻報道，葉綠素降解速率與氧氣濃度呈正相關，也就是說隨著氧氣濃度的增大，整個提取液的體系褪綠現(xiàn)象越嚴重，即葉綠素的保存率越低。

金屬離子

在酸性條件下，葉綠素分子卟啉環(huán)中的鎂離子可被氫離子取代，生成黃褐色的脫鎂葉綠素，脫鎂葉綠素分子中的氫離子又可被其他金屬離子如：銅、鋅、鈣離子取代，而生成相應的葉綠素金屬離子絡合物而恢復為綠色。

實驗表明，這種絡合物對酸、光、氧、熱等穩(wěn)定性大大提高了，這些離子均能使葉綠素保存率提高，使葉綠素能夠較長時間的保存，而且銅離子的效果優(yōu)于鋅離子。盡管葉綠素銅絡合物的色澤及其穩(wěn)定性比鋅絡合物的好，但銅離子屬于重金屬離子，毒害性較大，所以應該對其含量進行嚴格控制；而鋅是人體必需的微量元素，因此，在綠色果蔬加工過程中，采用鋅離子取代葉綠素分子中的鎂離子，形成較穩(wěn)定的葉綠素鋅絡合物，目前已經(jīng)得到了產(chǎn)業(yè)化應用。