高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱 - 固定相內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中做相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。

系統(tǒng)組成、工作原理

高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。

理解

分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數（或稱交換系數），凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。

在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很?。r，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。

延伸

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數不同是色譜分離的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。

高效液相色譜

（high performance liquid chromatography,HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等。是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

高效液相色譜是目前應用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進樣系統(tǒng)要求進樣便利切換嚴密；由于液體流動相粘度遠遠高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小于氣相色譜柱。HPLC應用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。

使用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由于被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號來判斷待側物所含有的物質。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用于化學和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。

發(fā)展歷史

1960年代，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。

1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實踐》一書，標志著高效液相色譜法 - HPLC）正式建立。在此后的時間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫(yī)學、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及色譜理論的發(fā)展。

1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸?？瓶颂m、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實現(xiàn)了高速傳質，為高效液相色譜技術的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基礎。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實現(xiàn)。1960年代研制出氣動放大泵、注射泵及低流量往復式柱塞泵，但后者的脈沖信號很大，難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代，往復式雙柱塞恒流泵，解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠，平均粒徑只有7μm，具有極好的柱效，并逐漸取代了無定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高，多次使用成為可能。1970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題，人們越來越認識到改變流動相的組成是提高選擇性的關鍵。

高效液相色譜的特點

高壓——壓力可達150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。

高速——流速為0.1～10.0mL/min。

高效——塔板數可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。

HPLC與經典液相色譜相比有以下優(yōu)點：

速度快——通常分析一個樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內即可完成。

分辨率高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。

色譜柱可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

主要類型

一.液固吸附色譜

1.1分離原理：液固色譜是基于各組分吸附能力的差異進行混合物分離的，其固定相是固體吸附劑。

1.2固定相：吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。

1.3流動相：流動相要求：

1.3.1選用的溶劑應當與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性

1.3.2選用的溶劑應有高純度，以防所含微量雜質在柱中積累，引起柱性能的改變。

1.3.3選用的溶劑性能應與所使用的檢測器相匹配，如果使用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測器，就不能用梯度洗脫。

1.3.4選用的溶劑應對樣品有足夠的溶解能力，以提高測定的靈敏度。

1.3.5選用的溶劑應具有低的黏度和適當低的沸點。

1.3.6應盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全

1.4應用：液固色譜是以表面吸附性能力為依據的，所以它常用于分離極性不同低的化合物，也能分離那些具有相同極性基團，但數量不同的樣品。

二.液液分配色譜

1.1分離原理；分配色譜法的原理與液液萃取相同，都是分配定律。

1.2固定相；分配色譜固定相由兩部分組成，一部分是惰性載體，另一部分是涂漬在惰性載體上的固定液。

1.3流動相；分內色譜中，要求流動相盡可能不與固定液互溶

1.4應用；既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物。由于不同極性鍵合固定相的出現(xiàn)，分離的選擇性可得到很好的控制。

三.鍵合相色譜

1.1分離原理

1.1.1正鍵合相色譜分離遠離：使用的是極性鍵和固定性，溶質在此類固定相上的分離機理屬于分配色譜。

1.1.2反鍵合相色譜分離原理：使用的是極性較小的鍵合固定相，其分離機理可用疏溶劑作用理論來解釋。

1.2固定相；按極性大小可分為非極性、弱極性、極性化學鍵合固定相三種。

1.3流動相

1.3.1正鍵合相色譜中，采用和反相液液分配色譜相似的流動相，流動相的主體成分為己烷或庚烷。

1.3.2反相鍵合相色譜中，流動相采用和反相液液分配色譜相似的流動相，主題為水。

1.4應用

1.4.1正鍵合相色譜法的應用：多用于分離各類極性化合物如染料、炸藥、多巴胺、氨基酸等。

1.4.2反鍵合相色譜法的應用：由于操作簡單，穩(wěn)定性和重復性好，該方法已成為一種通用型液相色譜分析方法。在生物化學、醫(yī)藥研究、食品分析和環(huán)境污染分析等多個領域有了很大的應用和發(fā)展。

四.凝膠色譜

凝膠色譜又稱分子排阻色譜，它是按照分子尺寸大小順序進行分離的一種色譜方法。凝膠色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料，有一定的形狀和穩(wěn)定性。根據所用流動相的不同，凝膠色譜法可以分為兩類：即用水溶劑做流動相的凝膠過濾色譜法（GFC）與用有機溶劑如四氫呋喃做流動相的凝膠滲透色譜法（GPC.

應用

高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質。

與試樣預處理技術相配合，HPLC所達到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能，能夠分離復雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離。

HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復利用，流出組分易收集等優(yōu)點，因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機分析等各種領域。高效液相色譜儀與結構儀器的聯(lián)用是一個重要的發(fā)展方向。

液相色譜-質譜連用技術受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等；液相色譜-紅外光譜連用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。

故障處理

LC-10AT高效液相色譜儀是日本島津公司1996 年的產品，檢測器為可變波長紫外檢測器,色譜柱為島津公司的ODS – C18,大連依利特的ODS -C18。

八年的日常工作中遇到了幾種故障，如故障1經咨詢島津公司的工程師后，得以解決；故障2、故障5是頻繁碰到的問題等，特作總結如下：

故障1

流動相內有氣泡，關閉泵，打開泄壓閥，打開purge鍵，清洗脫氣，氣泡不斷從過濾器冒出，進入流動相，無論打開purge鍵幾次，都無法清除不斷產生的氣泡原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內，過濾器內部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團，阻塞了過濾器，緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下經過濾器進入流動相。

處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時，輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清洗幾次，打開泄壓閥，打開purge鍵，清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過濾器冒出，繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出，說明過濾器內部的霉菌菌團已被硝酸破壞，流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥，打開泵，流速調至1.0～3.0ml/min，純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干凈。關閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時即可。

故障2

柱壓高原因⑴緩沖液鹽分如乙酸銨等沉積于柱內；⑵樣品污染沉積。

處理對于第一種情況先用40～50℃的純水,低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應提高流速沖洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘；對于第二種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定），再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。

故障3

既無壓力指示，又無液體流過。

原因⑴泵密封墊圈磨損；⑵大量氣泡進入泵體。

處理對于第一種情況，更換密封墊圈；對于第二種情況，在泵作用的同時，用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。

故障4

壓力波動大，流量不穩(wěn)定.

原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。

處理工作中注意觀察流動相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗.

故障5

出峰不佳，峰分叉。

原因⑴色譜柱被污染；⑵柱頭填料塌陷。

處理對于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定），再換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對于第二種情況,擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分 - 污染的填料），裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。

故障6

峰面積重復性不佳。

原因⑴進樣閥漏液；⑵加樣針不到位。

處理對于第一種情況更換進樣閥墊圈；對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉換到INJECT狀態(tài)，以保證進樣量的準確。日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，如要注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲液器內的溶液如長時間未用應清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無機鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質，完全溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜柱的使用壽命，同時避免注射過濃的樣品溶液，以免殘留液在進樣閥內析出固體引起堵塞；色譜柱作好標記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。